生物通報道：新一代測序技術在爆炸式發(fā)展的同時，也衍生出許多其他技術創(chuàng)新。RNA深度測序（RNA-Seq）就是其中之一，這項技術使我們對細胞發(fā)育及其調控機制的理解，達到了的深度和廣度。盡管研究細胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現(xiàn)大大拓展了轉錄組研究的規(guī)模，取得了累累碩果，這些是傳統(tǒng)技術難以企及的。
RNA-seq可以獲得相當驚人的數(shù)據(jù)量，而這恰恰是一柄劍。豐富的數(shù)據(jù)量蘊含著大量的寶貴信息，但這樣的數(shù)據(jù)需要復雜的生物信息學分析，才能從中提取到有意義的結果。正因如此，數(shù)據(jù)分析可以說是RNA-seq的重中之重。
RNA-seq有非常廣泛的應用，但沒有哪個分析軟件是的。科學家們一般會根據(jù)自己的研究對象和研究目標，采用不同的數(shù)據(jù)分析策略。現(xiàn)在人們已經(jīng)發(fā)表了大量的RNA-seq和數(shù)據(jù)分析方案，對于剛入門的新手來說難免有些無所適從。
佛羅里達大學、加州大學Irvine分校等單位的研究人員在一月二十六日的Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq生物信息學分析的現(xiàn)行標準和現(xiàn)有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNA-seq數(shù)據(jù)分析指南。這將成為開展RNA-seq研究的寶貴參考資料。
這份指南覆蓋了RNA-seq數(shù)據(jù)分析的所有主要步驟，比如質量控制、讀段比對、基因和轉錄本定量、差異性基因表達、功能分析、基因融合檢測、eQTL圖譜分析等等。研究人員繪制的RNA-seq分析通用路線圖（標準Illumina測序），將主要分析步驟分為前期分析、核心分析和分析三類。前期預處理包括實驗設計、測序設計和質量控制。核心分析包括轉錄組圖譜分析、差異基因表達和功能分析。分析包括可視化、其他RNA-seq技術和數(shù)據(jù)整合。
研究人員在文章中探討了每個步驟所面臨的挑戰(zhàn)，也評估了一些數(shù)據(jù)處理方法的潛力和局限。此外，他們還介紹了RNA-seq數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)類型的整合。這種數(shù)據(jù)整合可以將基因表達調控與分子生理學和功能基因組學關聯(lián)起來，如今越來越受到研究者的歡迎。
這篇文章在結尾處介紹了一些為轉錄組領域帶來改變的新技術，特別是單細胞RNA-seq和長讀取測序技術帶來的機遇和挑戰(zhàn)。
2015年年初，RNA-Seq的數(shù)據(jù)分析方法如雨后春筍般涌現(xiàn)。三月份，Nature集團旗下刊物發(fā)表了三篇介紹RNA-Seq數(shù)據(jù)分析新方法的文章，一篇發(fā)表在《Nature Methods》上，另外兩篇發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。這三篇文章有一位共同的作者，那就是約翰霍普金斯大學計算生物學中心的Steven Salzberg，生物信息學和計算生物學領域的杰出科學家。Salzberg通過這些文章中分別介紹了三種新工具：HISAT、StringTie和Ballgown。這些工具可以取代之前開發(fā)的早期工具，為RNA-Seq提供了全新的數(shù)據(jù)分析方法，從原始數(shù)據(jù)讀取到差異表達分析。（更多詳細信息參見：三篇文章介紹RNA-Seq數(shù)據(jù)分析的新工具）
RNA測序究竟有多可靠呢？由美國FDA牽頭的測序質量控制（SEQC）項目對RNA測序的準確性、可重現(xiàn)性和信息含量進行了綜合性評估。其初步調查結果發(fā)表在2014年09月的Nature Biotechnology雜志上，石樂明教授是這篇文章的通訊作者之一。研究人員用RNA參照樣本在多個實驗室的Illumina HiSeq、Life Technologies SOLiD、Roche 454平臺上進行檢測，主要評估RNA測序在接頭區(qū)域和差異性表達譜中的表現(xiàn)，并將其與芯片和定量PCR（qPCR）進行比較。研究表明，數(shù)據(jù)分析的算法會對RNA測序產(chǎn)生很大影響，不同算法生成的轉錄本數(shù)據(jù)存在很大差異。（更多詳細信息參見：石樂明教授Nature子刊：RNA測序到底可不可靠）
前幾天，浙江大學和哈佛大學的研究人員在Cell Reports雜志上發(fā)表了一項單細胞mRNA-seq研究?；虮磉_變異是小鼠胚胎干細胞（ESC）的一個重要特征，但人們一直不清楚這背后的具體原因。研究人員通過分析小鼠胚胎干細胞發(fā)現(xiàn)，這些細胞表現(xiàn)出的異質性是血清培養(yǎng)造成的。他們在其中鑒定了高度變異的基因簇，以及*的染色質狀態(tài)。研究顯示，雙價基因（bivalent gene）更容易出現(xiàn)表達變異。進一步研究表明，無血清培養(yǎng)可以減少小鼠ESC的異質性和轉錄組變異。這意味著，細胞內的網(wǎng)絡變異大多是細胞外的培養(yǎng)環(huán)境造成的。
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